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ELISA試劑盒試劑配制研究方法

2014-08-09 [964]

ELISA試劑盒以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應后用磁鐵的吸引進行分離,洗滌利便,一般均配以特殊儀器。為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣,可應用如下的試驗:用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本,將它們進行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預定的ELISA操縱步驟進行測定,然后比較結果。
ELISA試劑盒載體的外形主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。良好的ELISA板應該是吸附機能好,空缺值低,孔底透明度高,ELISA試劑盒各板之間、統一板各孔之間、統一板各孔之間機能相近。再者,球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于*反應狀態,因此珠式ELISA的反應往往更為敏捷。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力,其聯結多發生在Fc段上,抗體結合點暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。
酶聯免疫試劑盒操作步驟:

1.取出酶標板,設空白孔,依照次序對應分別加入100μl的標準品于空白微孔中。
2.分別標記樣品編號,加入100μl的稀釋樣品于空白微孔中。
3.將酶標板置于37℃溫育30分鐘。
4.將酶標板板取出,將其中的液體甩去,每個孔中全部加滿應用洗滌液后,立即甩去液體。
5.每個孔中加滿應用洗滌液后,輕微振搖酶標板30秒后將孔中的應用洗滌液甩去,在吸水紙上將酶標板拍干。
6.重復第5個步驟5次,在吸水紙上將酶標板拍干。
ELISA試劑盒中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:
1.固相載體的選擇:許多物質可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板

2.包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。
3.酶標記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定。
4.酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應,而本身無色。

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